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          大腸菌群和糞大腸菌的檢驗

          一、實驗目的要求
          1、 了解大腸菌群在食品衛生檢驗中的意義。
          2、 學習并掌握大腸菌群檢驗的原理和方法。
          二、原理
          大腸菌群系指一群能發酵乳糖,產酸產氣,需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。一般認為該菌群細菌可包括:大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。該菌主要來源于人畜糞便,故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量,具有廣泛的衛生學意義。它反映了食品是否被糞便污染,同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。
          食品中大腸菌群數系以每100g(或ml)檢樣內大腸菌群最近似數(the most probable number-簡稱MPN)表示。
          三、試劑和儀器
          (一)最先準備的器材
          規格名稱 數量 用途
          1、500ml廣口瓶 1個 稀釋樣品
          2、500ml三角瓶 2個 制生理鹽水
          3、250ml三角瓶 1個 制EMB瓊脂
          4、18×180mm試管 8支 稀釋及制雙料乳糖膽鹽發酵管
          5、18×150mm試管 20~25支 單料乳糖膽鹽發酵管、乳糖發酵管
          6、13×130mm試管 20支 制蛋白胨水、EC肉湯
          7、1ml移液管 5 支
          8、10ml移液管 3 支
          9、直徑為90mm平皿     12套  制EMB平板
          10、250ml量筒 1支
          (二)應滅菌消毒的器材
          剪刀1把 開瓶器  不銹鋼藥匙1把 滴管膠頭4只  稱量紙適量
          (三)應制備的培養基
          培養基總量 所用容器
          1、 0.85%NaCl生理鹽水 300ml   500ml三角瓶
          2、 乳糖膽鹽發酵管 
          雙料: 10ml/支 5支 60ml 18×180mm試管(裝有導管)
          單料: 10ml/ 8支 90ml 18×150mm試管(裝有導管)
          3、 EMB瓊脂: 1瓶 120ml 250ml三角瓶 
          4、 乳糖發酵管: 3ml/支 5支 20ml 13×130mm試管(裝有導管)
          5、 EC肉湯: 3ml/支 6支 20ml 13×130mm試管(裝有導管)
          6、 蛋白胨水: 2ml/支 10支 20ml 13×130mm試管
          四、實驗內容
          (第一天) 樣品處理及初發酵接種:
          所需培養基與器材:
          u 培養基:
          1. 0.85%NaCl生理鹽水: 300ml 1瓶
          2. 乳糖膽鹽發酵管 
          雙料: 10ml/支 3~5支 18×180mm試管(有導管)
          單料: 10ml/支 6~8支 18×150mm試管(有導管)
          u 滅菌器材:
          500ml廣口瓶(內帶5mm帶玻璃珠) 1~2個
          18×180mm試管 3支
          250ml量筒 1支
          1ml移液管 5 支
          10ml移液管 3支
          當樣品袋裝樣品時:消毒酒精、棉花、無菌剪刀、稱量紙、不銹鋼藥匙、橡皮膠頭3只;
          當樣品瓶裝樣品時:石炭酸消毒紗布兩塊、開瓶器。
          (一)、樣品處理(無菌操作)
          Ø 樣品:瓶裝飲料或釀造酒類:
          用點燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌,用石炭酸紗布蓋好,再用滅菌的開瓶器將蓋打開,將含二氧化碳的樣品倒入一信滅菌瓶內,加蓋假蓋,口勿蓋緊,在其上覆蓋在一塊滅菌紗布,輕輕搖蕩,待氣體全部逸出后,媽樣進行稀釋。
          Ø 乳制品:
          袋裝奶粉用75%的酒精棉球涂擦消毒袋口,以無菌操作取樣,放入滅菌的三角瓶內,將225mL溫熱的滅菌生理鹽水徐徐加入(先用少量生理鹽水將奶粉調成糊狀,再全部加入,以免結塊)。
          (二)、 檢樣稀釋與乳糖膽鹽發酵試驗----[初發酵](無菌操作)
          1、 用無菌量筒量取225mL滅菌生理鹽水倒入滅菌玻璃瓶內,用10ml移液管吸取9mL生理鹽水注入無菌試管中,共2支,備用。 
          2、 以無菌操作將檢樣25mL(g)放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質器,以8 000~10000r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。
          3、 用10ml移液管吸取1:10的稀釋液10ml分別注入雙料乳糖膽鹽發酵管中:共3支。
          4、 用1ml移液管吸取1∶10的稀釋液1ml分別注入單料乳糖膽鹽發酵管中:共3支。
          5、 用同上一支1mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內,換一支吸管,吸吹5次,或振搖試管混勻,做成1∶100的稀釋液。再用這支吸管吸取1∶100稀釋液1mL分別注入單料乳糖膽鹽發酵管中:共3支。
          ² 注意:做10倍遞增稀釋時,每遞增稀釋一次,要換用1支1mL滅菌吸管。
          ² 放入培養箱培養:
          將接種后的乳糖膽鹽發酵管置36±1℃溫箱內,培養24±2h,如所有乳糖膽鹽發酵管都不產酸不產氣,則可報告為大腸菌群陰性;如有產酸產氣者(培養液由紫藍色變成黃色并有氣泡),則按下列程序進行試驗。
          (第二天)進行EMB平板分離,[EC肉湯、蛋白胨水接種(糞大腸菌群檢驗)]:(無菌操作)
          所需培養基與器材:
          u 培養基:
          1. EMB瓊脂平板 5只
          2. EC肉湯: 5支
          3. 蛋白胨水: 5支
          u 器材:
          44.5±0.2℃水浴箱,接種環。
          (一)、接種EMB平板進行分離培養
          將產氣的發酵管分別轉種在EMB瓊脂平板上(一管對一個平板),置36±1℃溫箱內,培養18~24h,然后取出,觀察菌落形態,并挑取可疑菌落做:革蘭氏染色和證實試驗。
          在EMB平板上的典型菌落:呈紫黑色,圓形,邊緣整齊,表面光滑濕潤,常有金屬光澤。由于藥物影響,亦呈現紫色、粉紫、中心灰紫、無黑心、濕潤等,常為大腸桿菌,均應注意挑選。
          (二)、接種EC肉湯(用于糞大腸菌群檢驗)
          用接種環將所有產氣的乳糖膽鹽發酵管培養物轉種于EC肉湯管內(一管對一個管),置44.5±0.2℃水浴箱內(水浴箱內的水面應高于EC肉湯液面),培養24±2h。經培養后,如所有EC肉湯管均不產氣,則可報告:為陰性;如有產氣者,則將所有產氣的EC肉湯管分別轉種于伊紅美藍瓊脂平板上,置36±1℃培養18~24h,凡平板上有典型菌落者,則證實為糞大腸菌群陽性。
          (三)、接種蛋白胨水:(用于糞大腸菌群檢驗)
          用接種環將所有產氣的乳糖膽鹽發酵管培養物轉種于蛋白胨水內(一管對一個管 ),置44.5±0.2℃水浴箱內,培養24±2h。同時取一蛋白胨水培養基不接種,一起培養做對照試驗。
          (第三天)進行乳糖發酵(證實試驗)接種、鏡檢、靛基質試驗、觀察EC肉湯發酵結果
          所需培養基與器材:
          u 培養基:
          1. 乳糖發酵管:5支
          2. 靛基質試劑、(歐—波試劑)
          3. 革蘭氏染色液
          u 器材:顯微鏡
          (一)、乳糖發酵接種
            在EMB平板上的典型菌落:呈紫黑色,圓形,邊緣整齊,表面光滑濕潤,常有金屬光澤。由于藥物影響,亦呈現紫色、粉紫、中心灰紫、無黑心、濕潤等,常為大腸桿菌,均應注意挑選
          從EMB平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1~2個同時接種乳糖發酵管,置36±1℃溫箱內培養24±2h,觀察產氣情況。
          (二)、進行鏡檢
          從EMB平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1~2個進行革蘭氏染色。大腸菌群菌:革蘭氏染色陰性無芽胞短桿菌。
          (三)、進行靛基質試驗
          向培養后的蛋白胨水中沿管壁加入靛基質試劑(歐—波試劑)0.5mL,靜置片刻,觀察液面。陽性反應者,液面呈玫瑰紅色;陰性反應液面呈試劑本色。則證實為糞大腸菌群陽性。
          (四)、觀察EC肉湯發酵結果
          如所有EC肉湯管均不產氣,則可報告:為陰性;如有產氣者,則將所有產氣的EC肉湯管分別轉種于伊紅美藍瓊脂平板上,置36±1℃培養18~24h,凡平板上有典型菌落者,則證實:為糞大腸菌群陽性。
          (第四天)觀察乳糖發酵結果及器材的消毒和清洗
          (一)、觀察乳糖發酵結果
          觀察:乳糖發酵管內是否有氣體產生
          u 凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,即可報告為大腸菌群陽性。
          (二)、查表報告結果
            根據證實為大腸菌群陽性的管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。
          根據證實為糞大腸菌群的陽性管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN值。

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